Coloraciones

Diagnóstico de Enteroparásitos
Diagnóstico de Hemoparásitos

El examen microscópico de materia fecal consiste en la realización de montajes húmedos. La observación microscópica puede ser directa sin y con coloración y frotis coloreados permanentes.

Se usa principalmente para observar las características morfológicas de los protozoarios y detectar la movilidad de los mismos en su forma de trofozoito. El frotis directo se prepara con una pequeña cantidad (una gota) de materia fecal entre porta y cubre, no debe ser  mayor porque resultaría demasiado espesa para el examen, ni menor porque disminuiría la posibilidad de encontrar parásitos. La observación se realiza utilizando un objetivo de 10x aumentos y ante un elemento sospechoso se examina con 40x aumentos.

Para poder observar con más detalle la morfología de los protozoarios (especialmente los núcleos) se puede hacer un montaje húmedo coloreado, colocando una gota de colorante en el borde del portaobjeto o se prepara un nuevo montaje. Varios tipos de soluciones de yodo son recomendadas, por ejemplo de Lugol y de Dobell y O´ Connor y otras como solución de eosina o azul de metileno.

Los trofozoitos y quistes de protozoarios, huevos o larvas de helmintos y ooquistes de Isospora belli pueden ser identificados en el frotis directo. Los ooquistes de Cryptosporidium difícilmente son observados, salvo en grandes infecciones, al igual que las esporas de Microsporidium que son muy pequeñas y de forma semejante a restos en materia fecal.

La detección y la correcta identificación de la mayoría de los protozoarios intestinales depende del examen de estos frotis observados con un aumento de 100x. La utilización de frotis permanentes no solamente nos proporciona un archivo permanente de los protozoarios, sino que pueden ser utilizados, cuando la identificación es dificultosa, para consultar con especialistas

El método más clásico es la hematoxilina férrica de Heidenhain, pero la mayoría de los laboratorios seleccionan técnicas más breves como la coloración Tricrómica.

Es importante mencionar que la mayoría de las dificultades en las coloraciones de trofozoitos y quistes se deben a una fijación inadecuada, al uso de preparados muy densos o por materias fecales muy viejas.

Las coloraciones empleadas para los frotis permanentes son:

Coloración Tricrómica

La técnica Tricrómica de Wheartley es una modificación de la técnica original de Gomori para tejidos. Es un procedimiento rápido y simple para la detección de protozoarios, células humanas (macrófagos, glóbulos rojos, polimorfonucleares) y levaduras.

Estas coloraciones no son recomendadas para huevos o larvas de helmintos debido a que se observan oscuros por la retención de exceso de colorante. Los ooquistes de Isospora belli se observan mejor en preparaciones húmedas y los ooquistes de Cryptosporidium parvum y Cyclospora generalmente no son reconocidas por la coloración Tricrómica.

Las muestras pueden ser materias fecales fresca fijadas inmediatamente en fijador de Schaudinn o materia fecal conservada en PVA, SAF o MIF. Con una fijación adecuada, el material de base generalmente toma un color verde ya que los protozoarios tienen un citoplasma que va del verde azulado al púrpura y la cromatina nuclear y cuerpos de inclusión se tiñen de color rojo a rojo púrpura.

Hematoxilina férrica fue la coloración usada para describir la morfología de protozoarios intestinales hallados en humanos. Aunque existen muchas modificaciones de la técnica solo se describirán dos métodos: Spencer- Monroe y Tompkins-Miller, los cuales pueden ser usados con materia fecal fresca o conservada en SAF o PVA.

Las dos técnicas son más prolongadas que la coloración Tricrómica y se diferencian de ésta porque emplean ácido fosfotúngstico para decolorar a los protozoarios, obteniéndose mejores resultados para la diferenciación de los mismos.

Con estas coloraciones el material de base y los microorganismos se tiñen de azul grisáceo o negro con estructuras nucleares y cuerpos de inclusión más oscuros que el citoplasma.

La coloración permite la diferenciación de protozoarios, células humanas, cristales de Charcot Leyden, levaduras y no es recomendada para huevos o larvas de helmintos, ni para ooquistes de I. belli, C. parvun y Cyclospora.

Permite observar los ooquistes de Cryptosporidium, Cyclospora e Isospora sp. debido al comportamiento ácido resistente de la cubierta quística de estos parásitos. Si bien las esporas de Microsporidium también poseen esta propiedad, su tamaño hace difícil su identificación por esta coloración.

Las muestras usadas son materia fecal fresca, concentrada o preservada con formol o SAF (no se recomienda las conservadas en PVA), fluidos duodenales, esputos, lavados broncoalveolares o biopsias.

Los ooquistes de Cryptosporidium, Cyclospora e Isospora sp. se observan de color rosa a rojo destacándose sobre un fondo azul. La intensidad de la coloración depende del espesor del preparado, del porcentaje de ácido en la decoloración y del tiempo de contacto con el mismo.

El fundamento y las indicaciones generales para esta técnica son similares a los de la coloración Kinyoun y solo se diferencia en el calentamiento del extendido previo al uso del colorante.

Permite colorear ooquistes de Cryptosporidium y Cyclospora.

Se emplea para la búsqueda de esporas de Microsporidia. Los cambios con respecto a la técnica anterior son: la temperatura de incubación a 50º C y el tiempo de coloración de 10´.

El examen microscópico de sangre es importante para el diagnóstico de Trypanosoma cruzi, Plasmodium y microfilarias. Si bien algunos parásitos como trypanosoma y microfilarias son detectados por su forma y su movilidad característica en sangre fresca, su identificación específica depende del uso de un colorante permanente.

El rendimiento en la búsqueda de estos parásitos mejora con el uso de distintas técnicas de concentración y la recolección en forma seriada.

Las infecciones parasitarias pueden detectarse con dos tipos de extendidos de sangre: grueso y fino (gota gruesa y gota fina). El primero permite examinar una mayor cantidad de sangre y el segundo permite observar mejor las características morfológicas de los parásitos. Las coloraciones generalmente usadas son: May Grünwald Giemsa y Giemsa diluída.

Distintos parásitos, como protozoos y helmintos, pueden diagnosticarse en materiales como: esputo, aspirados obtenidos de sigmoideoscopía, traqueobronquiales, de material quístico, absceso pulmonar, hepático, material de ganglio, bazo, hígado, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, de úlceras cutáneas y material de biopsia de piel, músculo, etc.

Las técnicas de coloración usadas son:

• Coloración de azul de toluidina y/ o metenamina de plata para Pneumocystis carinii en esputos y lavados broncoalveolares.
• Coloración de Ziehl-Neelsen para Cryptosporidium parvum en esputo.
• Coloración Tricrómica y/o hematoxilina férrica para Entamoeba histolytica en absceso pulmonar o hepático, aspirado de úlceras o biopsias de piel.
• Coloración de Giemsa o May Grünwald Giemsa para microfilarias en biopsias de piel o para diagnosticar tripanosomiasis africana, leishmaniosis o amebiasis en ganglios linfáticos, bazo, hígado, médula ósea, etc.

 

Yodo (cristales pulverizados) 5 g

Yoduro de potasio 10 g

Agua destilada 100 ml

Disolver el KI en agua, luego incorporar lentamente los cristales de yodo. Agitar bien. La solución base filtrada se conservará estable por varios meses. Antes de usar, diluir unas cinco veces con agua destilada. Guardar las soluciones en botellas de cristal oscuro.

Yodo (cristales pulverizados) 1 g

Yoduro de potasio 2 g

Agua destilada 100 ml

Disolver el KI en agua, luego incorporar lentamente los cristales de yodo. Agitar bien. La solución filtrada está lista para usarse. Cuando la solución pierda fuerza pueden agregarse más cristales de yodo para recuperar la capacidad de coloración. Filtrar antes de usar (dos veces) para evitar una sobrecoloración. Guardar las soluciones en botellas de cristal oscuro.

A 46,3 ml de una solución 0,2 M de ácido acético agregar 3,7 ml de una solución 0,2 M de acetato de sodio. A esta solución de pH 3.6, incorporar una pequeña cantidad de azul de metileno (0,06%).

Eosina 1 g

Alcohol 96% 10 ml

Agua destilada 90 ml

Colorante tricromo:

2R cromotropo 0,6 g

SF verde claro 0,3 g

Ac. fosfotúngstico 0,7 g

Ac. acético ( glacial) 1 ml

Agua destilada 100 ml

Agregar 1 ml de ácido acético glacial a los componentes secos. Dejar la mezcla en reposo de 15 a 30 minutos para su saturación y luego agregar 100 ml de agua destilada.

Procedimiento:

Alcohol 70% 5 minutos*

Alcohol 70% que contiene solución de Lugol 2 a 5 minutos

Alcohol 70% 5 minutos*

Alcohol 70% 2 a 5 minutos*

Colorante 30 minutos

Alcohol 90% acidificado con ácido acético al 1% 3 segundos

Alcohol absoluto humedecer

Alcohol absoluto 2 a 5 minutos

Alcohol absoluto 2 a 5 minutos

Xileno 2 pasos de 2 a 5 minutos*

* Pueden mantenerse varias horas o durante toda la noche

Colorante:

Solución I: Hematoxilina 10 g

Alcohol absoluto 1000 ml

Mantener el colorante en un frasco color caramelo y dejarlo madurar en un lugar iluminado naturalmente durante por lo menos una semana.

Solución II: Sulfato ferroso amoniacal 10 g

Sulfato férrico amoniacal 20 g

Cl H concentrado 10 ml

Agua destilada 1000 ml

Solución de trabajo: mezclar partes iguales de las soluciones I y II. Esta solución de trabajo se conserva durante 7 días.

Procedimiento:

Alcohol 70% 5 minutos*

Alcohol 70% más solución de Lugol 2 a 5 minutos

Alcohol 70% 5 minuto

Agua corriente 10 minutos

Colorante 4 a 5 minutos

Agua corriente 10 minutos

Alcohol 70% 5 minutos*

Alcohol 95% 5 minutos*

Alcohol absoluto 5 minutos*

Alcohol absoluto 5 minutos*

Xileno 2 pasos de 5 minutos*

* Pueden mantenerse varias horas o durante toda la noche

Colorante:

Solución A: disolver 4 g de fucsina básica en 20 ml de etanol al 95%.

Solución B: disolver 8 g de cristales de fenol en 100 ml de agua destilada.

Mesclar solución A y B.

Esta solución es estable un año a temperatura ambiente.

Procedimiento:

Cubrir con Carboxifucsina 1 a 5 minutos

Lavar con agua

Decolorar con H₂SO₄ 1% 1 minuto

Lavar con agua

Cubrir con azul de metileno 1% 30 segundos a 1 minuto

Lavar con agua y secar

Colorante:

Solución A: disolver 0,3 g de fucsina básica en 10 ml de etanol al 95%.

Solución B: disolver 5 g de cristales de fenol en 100 ml de agua destilada.

Mezclar solución A y B.

Esta solución es estable un año a temperatura ambiente

Procedimiento:

Cubrir con carboxifucsina

Calentar hasta desprendimiento de vapores 5 minutos

Lavar con agua

Decolorar con H₂OS₄ 1% 1 minuto

Lavar con agua

Cubrir con azul de metileno 1% 1 minuto

Lavar con agua y secar

Procedimiento:

Cubrir con metanol 5 minutos

Cubrir con Safranina al 1%

Calentar dos veces hasta desprendimiento de vapores 5 minutos

Lavar con agua

Decolorar con HCl 3% metanol 5 segundos

Lavar con agua

Cubrir con azul de metileno 1% 1 minuto

Lavar con agua y secar

Procedimiento:

Cubrir con May Grünwald  5 minutos

Agua estabilizada 1/50 2 a 3 minutos

Cubrir con Giemsa diluído 15 a 20 minutos (15 gotas de Giemsa en 10ml de agua estabilizada)

Lavar con agua

Procedimiento:

Cubrir con Giemsa diluído 30 a 60 minutos

(1 ml de Giemsa en 20 ml de agua estabilizada o 1 gota c/ ml de agua estabilizada)

Lavar con agua

Colorante:

Azul de toluidina 0,16 g

(ajustar la cantidad según el contenido de colorante a usar)

Agua destilada 60 ml

Ácido clorhídrico 2 ml

Etanol absoluto 140 ml

Disolver el colorante en el agua, agregar lentamente el ácido clorhídrico y finalmente el alcohol. Estable un año.

Reactivo de sulfatación:

Colocar un vaso de Koplin en un recipiente en agua con hielo. Verter 45 ml de ácido acético glacial dentro del vaso y agregar 15 ml de ácido sulfúrico. Mezclar suavemente y cerrar muy bien. Debe prepararse todas las semanas.

Procedimiento:

Reactivo de sulfatación 10 minutos (mezclar inmediatamente y después de 5 minutos)

Agua corriente 5 minutos

(absorber el exceso en papel de filtro)

Azul de toluidina 3 minutos

(absorber el exceso en papel de filtro)

Etanol 96º 10 segundos

Etanol 96º 10 segundos

Etanol absoluto 10 minutos

Xileno ( dos cambios) 10 segundos

Secar y colocar bálsamo

Procedimiento:

Metanol 10 minutos

Colorear con cromotropo a 50º 10 minutos

Alcohol ácido 14 segundos

Alcohol 95º 5 minutos

Alcohol absoluto 10 minutos

Xileno 10 minutos

Dejar secar y colocar bálsamo.