Técnicas de Concentración

Sedimentación espontánea
        Método de Sedimentación sencilla
        Método de Lumbreras modificado
        Método de Baermann- Moraes

Sedimentación por centrifugación
        Método de Charles Barthelemy modificada por Bacigalupo y Rivero
        Método de formol- éter o de Ritchie
        Método de Acetato de Etilo (macro y micro método)

Flotación
        Método de Faust o de sulfato de Zinc 33%
        Método de Willis Molloy o de solución saturada de cloruro de sodio
        Método de Sucrosa de Sheather

Técnicas cuantitativas para huevos
        Técnica de Beaver de recuento directo de huevos
        Técnica de recuento de huevos por dilución de Stoll- Hausheer
        Método de dilución de Stoll modificado
        Técnica de Kato- Katz
 

1. Homogeneizar unos 10 gramos de heces en 10 veces su volumen de agua corriente.
2. Verter la materia fecal en copas de vidrio o vasos de precipitado de 250 a 500 ml.
3. Dejar que sedimente durante 1 hora.
4. Eliminar por sifón los dos tercios superiores, o verterlos con cuidado, para eliminar los detritos
5. Agregar agua hasta llenar casi el recipiente y resuspender las heces con varilla.
6. Repetir la operación 1 o 2 veces más hasta que el sobrenadante quede relativamente límpido.
7. Eliminar este ultimo liquido y con una pipeta obtener una pequeña porción del sedimento para observación microscópica.

Este método es lento y de poca concentración para los protozoos intestinales. Para los huevos de helmintos, si bien es lento, tiene la ventaja de que sedimentan en el fondo del recipiente en un estado viable y sin deformación.

Se utiliza para el hallazgo de huevos de Fasciola hepática en materia fecal o bilis. Para estos huevos no se puede utilizar un método de centrifugación porque se rompen ni uno de flotación porque son muy pesados.

1. Colocar 2 ml de la muestra (heces o bilis) en una copa de Lumbreras o tubo de centrífuga.
2. Agregar 5 ml de solución detergente al 10% para emulsionar las grasas.
3. Agregar 0,5 ml de alumbre férrico al 1% para favorecer el gradiente de densidad.
4. Homogeneizar suavemente.
5. Dejar en reposo 30 minutos.
6. Sacar con pipeta pasteur una gota del fondo de la copa.
7. Observar microscópicamente.

Esta técnica es para la separación de larvas, se emplea principalmente en estrongyloidiasis, para concentrarlas a partir de heces, cultivos o tierra.

1. Colocar un embudo en un soporte vertical, agregando al vástago del embudo una goma de caucho cerrada con una pinza.
2. Verter agua en el embudo, a temperatura de 37º- 42º, hasta cerca del borde.
3. Colocar sobre el embudo una malla metálica o colador, cubierto con gasa doble de tal forma que haga contacto con el agua tibia.
4. Poner sobre la gasa 8 a 10 gramos de materia fecal, tierra o material de cultivo. Puede ponerse una bolsa con hielo en la parte superior del colador para acelerar el proceso.
5. Dejar de 60 a 90 minutos.
6. Las larvas migran por diferencia de temperatura y sedimentan en la porción de la goma de caucho de donde se colectan en un tubo por apertura de la pinza.

1. Mezclar 10 gramos de heces con 50 ml de solución fisiológica o agua de la canilla.
2. Tamizar a través de un colador metálico.
3. Filtrar sobre gasa en un embudo.
4. Recoger 10 ml del filtrado en un tubo de centrífuga.
5. Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm. Descartar el sobrenadante.
6. Repetir esta operación 3 veces o hasta que el sobrenadante quede límpido.
7. Resuspender el sedimento con solución fisiológica o agua de la canilla más 2 ml de éter sulfúrico. Tapar con tapón de goma y agitar vigorosamente para extraer las grasas.
8. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Descartar el tapón graso de un golpe seco, conservando el sedimento.
9. Examinar microscópicamente el sedimento.

1. Mezclar 10 gramos de heces con 50 ml de solución fisiológica o agua de la canilla.
2. Tamizar a través de un colador metálico.
3. Filtrar sobre gasa en un embudo.
4. Recoger 10 ml del filtrado sobre un tubo de centrífuga.
5. Centrifugar 5 minutos a 1500 r.p.m. Descartar el sobrenadante.
6. Repetir esta operación 3 veces o hasta que el sobrenadante quede límpido.
7. Resuspender el sedimento con formol al 10%. Dejar 10 minutos en reposo.
8. Agregar 2 ml de éter sulfúrico. Tapar con tapón de goma y agitar vigorosamente para extraer las grasas.
9. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Descartar el tapón graso de un golpe seco, conservando el sedimento.
10. Examinar microscópicamente el sedimento.

Macro método

1. Mezclar 10 gramos de heces con 50 ml de solución fisiológica o agua de la canilla.
2. Tamizar a través de un colador metálico.
3. Filtrar sobre gasa en un embudo.
4. Recoger 10 ml del filtrado sobre un tubo de centrífuga.
5. Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm. Descartar el sobrenadante.
6. Repetir esta operación 3 veces o hasta que el sobrenadante quede límpido.
7. Resuspender el sedimento con formol al 10%. Dejar 10 minutos en reposo.
8. Agregar 2 ml de acetato de etilo. Tapar con tapón de goma y agitar vigorosamente para extraer las grasas.
9. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Descartar el tapón graso de un golpe seco,  conservando el sedimento.
10. Examinar microscópicamente el sedimento.

Micro método

1. Colocar en un tubo de eppendorf 0,5 ml de materia fecal.
2. Hacer un lavado por centrifugación con agua destilada o de la canilla a 1500 rpm 5 minutos.
3. Retirar el sobrenadante con pipeta pasteur.
4. Agregar 0,3 ml de acetato de etilo.
5. Tapar el tubo y agitar vigorosamente para extraer las grasas.
6. Centrifugar 1 minuto a 1500 rpm. Descartar el tapón graso de un golpe seco, conservando el sedimento.
7. Examinar microscópicamente el sedimento.

Esta técnica es especialmente útil para quistes, huevos de Enterobius vermicularis y huevos de Hymenolepis nana. Todos los elementos parasitarios, con excepción de los huevos más pesados que el medio de flotación, se recuperan en altas concentraciones y en condiciones viables. La concentración de sulfato de zinc más útil para hacer flotar los elementos parasitarios más comunes tiene un peso específico de 1.180. Phillipson usó sulfato de magnesio (MgSO₄) en lugar de sulfato de zinc obteniendo la flotación de huevos de Clonorchis y Opisthorchis en heces.

1. Mezclar 10 gramos de heces con 50 ml de solución fisiológica o agua de la canilla.
2. Tamizar a través de un colador metálico.
3. Filtrar sobre gasa en un embudo.
4. Recoger 10 ml del filtrado sobre un tubo de centrífuga.
5. Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm. Descartar el sobrenadante.
6. Repetir esta operación 3 veces o hasta que el sobrenadante quede límpido.
7. Agregar al sedimento final 2 o 3 ml de solución de sulfato de zinc al 33% y homogeneizar con varilla.
8. Completar con sulfato de zinc el tubo de centrífuga sin volver a homogeneizar.
9. Centrifugar 1 o 2 minutos a 1500 rpm.
10. Extraer con aro de alambre unas gotas de la película superficial sin retirar el tubo de la centrífuga o haciéndolo con sumo cuidado para evitar que por agitación se destruya la película.

Solución saturada de sulfato de zinc al 33%

Sulfato de zinc puro 333 g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml

Esta técnica no requiere centrífuga y es útil, principalmente, para huevos de Uncinarias, Ascaris, Trichuris e Hymenolepis, que flotan fácilmente, pero también sirve para otros parásitos. Se utiliza con mucha frecuencia en parasitología veterinaria, por la facilidad de realización en el campo.

Los huevos de los helmintos intestinales más comunes, no se dañan por este proceso, pero los de Schistosoma, larvas de Uncinarias y Strongyloides, así como los quistes de protozoarios, se contraen bastante. Otra desventaja es que los huevos de Clonorchis, Opisthorchis y otras especies tienen un peso específico mayor que el de la solución saturada y no flotan en ella.

1. Disolver sal de cocina en agua caliente hasta que haya saturación; la solución debe tener como mínimo, una densidad de 1,20.
2. Mezclar aproximadamente 1 gramo de heces con 10 o 20 ml de la solución saturada.
3. Trasladar la mezcla a un tubo o probeta y llenar con la solución hasta el borde.
4. Tomar 1 o 2 gotas de la película superficial con aro de alambre o pipeta pasteur.
5. Observar al microscopio.

Este método es útil para quistes y huevos livianos y especialmente se lo recomienda para la concentración de ooquistes de Cryptosporidium sp. pues los ooquistes flotan de manera diferencial a las levaduras en una capa de líquido más arriba que éstas exhibiendo una tonalidad rosada característica que permite su identificación sin necesidad de coloración permanente.

1. Filtrar con gasa la materia fecal.
2. Lavar con agua de la canilla o agua destilada por centrifugación hasta sobrenadante límpido.
3. Agregar 2 o 3 ml de solución de Sheather al sedimento fecal.
4. Mezclar suavemente con varilla de vidrio.
5. Dejar reposar 3 minutos o centrifugar 1 minuto a 1500 rpm.
6. Retirar 1 o 2 gotas de la película superficial.
7. Observar al microscopio.

Solución de sucrosa de Sheather

Sacarosa 500 g
Fenol 6,5 g
Agua destilada 320 ml

Es el más simple y razonablemente seguro cuando es realizado por una persona experimentada. En el método original Beaver utilizó una célula fotoeléctrica calibrada para preparar un frotis de exactamente 2 mg de heces. Para exámenes de rutina éste no resulta práctico y por consiguiente el procedimiento ha sido modificado de modo que se prepara un frotis directo de heces de aproximadamente 2 mg. Los recuentos de huevos en el frotis son comunicados como huevos por frotis y pueden efectuarse los cálculos apropiados para determinar huevos por gramo de heces.

Este es el procedimiento más ampliamente usado con el propósito de estimar la carga de gusanos. Se utiliza un matraz con líneas grabadas al nivel de 56 y 60 ml. para facilitar el llenado con hidróxido de sodio y materia fecal.

1. En un matraz calibrado poner 0,1 N de hidróxido de sodio hasta la marca 56 ml.
2. Agregar materia fecal al matraz hasta la marca de 60 ml. Esta cantidad de heces equivale a 4 gramos.
3. Agregar perlas de vidrio y agitar vigorosamente para lograr una suspensión uniforme. Si la muestra es consistente, puede colocarse en la heladera durante la noche antes de agitarlo para facilitar su desmenuzamiento.
4. Con pipeta calibrada retirar rápidamente 0,15 ml. de suspensión y colocarla en un portaobjeto.
5. Contar los huevos en el microscopio sin usar cubreobjeto.
6. Multiplicar el resultado por 100 para obtener la cantidad de huevos por gramo de heces.
7. La estimación (huevos por gramo) obtenida variará según la consistencia de las heces. Los valores de corrección que deben usarse para convertir la estimación son:

x 1,5 para deposición formada
x 2 para deposición semiformada
x 3 para deposición semilíquida
x 4 para deposición líquida.

Los recuentos de huevos en muestras líquidas generalmente no son seguros; los recuentos más precisos son los obtenidos de muestras formadas o semiformadas

1. Llenar un tubo de centrífuga de 15 ml, graduado, hasta la marca de 14 ml con hidróxido de sodio 0,1 N.
2. Agregar heces hasta alcanzar la marca de 15 ml.
3. Mezclar con varilla.
4. Si la deposición es dura, dejar la suspensión en reposo durante varias horas.
5. Agitar el tubo hasta que el contenido se mezcle por completo y extraer rápidamente 0,15 ml de suspensión.
6. Transferir el material a un portaobjeto, cubrirlo con un cubreobjeto y contar los huevos en toda la preparación
7. Multiplicar el número de huevos contados por 100 y aplicar las correcciones como en el método anterior.

El método es útil para el recuento de huevos de helmintos, pero es poco sensible para infecciones leves.

Se coloca 1 gramo de heces sobre un trozo de papel de aluminio. Sobre la muestra se dispone una malla metálica o plástica fina y se raspa sobre el tamiz con una jeringa de tuberculina sin punta hasta que la deposición llegue a una marca hecha previamente y que corresponde a un volumen de 35 mm³ (aproximadamente 50 gramos de heces). Para esto existen medidas en el comercio. La deposición se coloca sobre un portaobjeto y se cubre con papel celofán empapado en solución de verde de malaquita (1ml de verde de malaquita al 3% en solución acuosa en 100 ml de agua destilada y 10 ml de glicerina pura 50 ml). El portaobjeto se invierte y sobre una superficie dura se presiona suavemente para extender la muestra. Posteriormente se deja clarificar la preparación durante una hora a temperatura ambiente. Se cuentan los huevos.

El número de huevos se calcula con la siguiente fórmula:

Huevos/ g de heces = Número huevos contados (20x) / factor de consistencia

El factor de consistencia es 1 para deposición sólida, 2 para semisólida y 3 para la líquida.